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NADPH氧化酶(NAO)试剂盒

产品编号:4188202
产品类别:其他试剂盒
纯度规格:微板法
包装规格:48样
市场价:询价
优惠价:立即咨询

NADPH氧化酶(NAO)是一个典型的膜蛋白,催化 NADPH氧化生成 NADP+,并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病(GCD),在植物中,该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。

NADPH氧化酶(NAO)将 NADPH氧化为 NADP+的同时生成超氧阴离子(O2 .- ),接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂 DPI排除背景值。最终检测生成的有色物质在 450nm处的吸光值,即可计算得出 NAO酶活性大小。

试剂盒组分与配制:

试剂名称

规格

保存条件


提取液

液体 60mL×1瓶

4℃保存


试剂一

液体 0.25mL×1支

-20℃保存

若凝固可放置室温或 25℃水浴溶解。

试剂二

液体 1mL×1支

-20℃保存


试剂三

粉体 mg×2支

-20℃保存

用前甩几下或离心使粉剂落入底部,分别加 0.55mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,三天内用完。

试剂四

液体 1mL×1支

-20℃保存


所需的仪器和用品:

酶标仪、96孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

NADPH氧化酶(NAO)活性测定:

建议正式实验前选取 2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、样本制备

①组织样本:

取约 0.1g组织,加入 1mL提取液,在 4oC或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。4oC×12000rpm离心 10min,取上清作为待测液。

【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例进行提取

②细菌/细胞样本:

先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约 500万细菌或细胞加入 1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);12000rpm 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为 500~1000:1的比例进行提取。

③液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。

2、上机检测:

①酶标仪预热 30min以上,设定温度 37℃,调节波长至 450nm。

②所有试剂解冻至室温(25℃)。

③在 96孔板中依次加入:

试剂名称(μL)

测定管

对照管

样本

20

20

提取液

150

145

试剂一
5
37℃孵育 5min(可能会产生沉淀,但不影响后续测定)
试剂二1010
试剂三1010
试剂四1010
37℃避光孵育 20min,于 450nm读取吸光值 A,ΔA=A测定-A对照。

【注】若△A的值在零附近,可以延长反应时间 T(如至 40min或更长),则改变后的反应时间 T需代入公式重新计算。

结果计算:

1、按样本蛋白浓度计算:

酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。

NAO(△OD450/min/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=250×ΔA÷Cpr

2、按样本鲜重计算:

酶活定义:每克组织每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。

NAO(△OD450/min/g鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=250×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算:

酶活定义:每 1万个细菌或细胞每分钟在反应体系中使 450nm处吸光值变化 0.01为一酶活单位。

NAO(△OD450/min/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.01÷T=0.5×ΔA

V---加入提取液体积,1mL;

V1---加入样本体积,0.02mL;

T---反应时间,20min;

W---样本质量,g;

500---细胞或细菌总数,万;

Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL;

建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。

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